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    應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)估算有效光反應(yīng)中心含量

    發(fā)布時(shí)間: 2020-02-21  點(diǎn)擊次數(shù): 1953次

          PSII可與PSI協(xié)同從水中獲取電子生成還原體、驅(qū)動(dòng)光化學(xué)反應(yīng)和植物營養(yǎng)循環(huán)。因此有效PSII光反應(yīng)中心([PSII]active)的含量可作為植物生產(chǎn)力評(píng)估的基礎(chǔ)因子,同時(shí)也是評(píng)估植物光合速率、研究植物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵。而對(duì)于液體樣品,[PSII]active含量同樣是評(píng)估水生生物光合作用速率以及分析浮游植物對(duì)脅迫的響應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)。但傳統(tǒng)上缺少穩(wěn)定、可靠、快速的 [PSII]active含量的測量方法。

          傳統(tǒng)上對(duì)于[PSII]active的測量:

    • 免疫印跡法測定PSII蛋白復(fù)合體的豐度:

            不能說明其中能夠貢獻(xiàn)于持續(xù)電子傳遞的、光化學(xué)有效的PSII蛋白復(fù)合體的含量。

    • 放氧法對(duì)[PSII]active含量值進(jìn)行測量:

            耗時(shí)長:每個(gè)樣品要測量大概15 min;不準(zhǔn)確;需要濃縮懸浮物樣品至很高的濃度,才能檢測到明顯的參數(shù)變化。同時(shí),在測量過程中,氧氣的消耗及其多種代謝途徑會(huì)影響測量結(jié)果。因此不適合測量培養(yǎng)物的動(dòng)態(tài)生理變化,更不適合測量持續(xù)變化環(huán)境中的自然種群。因而無論對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研究還是野外實(shí)驗(yàn),很多情況下都不適用。

          本文將介紹加拿大蒙特愛立森大學(xué)的Campbell教授的研究------應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行[PSII]active含量估算的方法。該方法有效解決了傳統(tǒng)測量方法存在的問題。其原理是:在一定體積下:

    a)Fo強(qiáng)度與[PSII]active色素含量相關(guān);

    b)σ’PSII與PSII色素總含量相關(guān)。

            因此,Fo/σ’PSII可以代表單位體積的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而這兩個(gè)參數(shù)都可以利用快速飽和及弛豫熒光誘導(dǎo)程序(fast repletion and relaxation (FRR) ?uorescence induction)獲得。注:σ’PSII: 光適應(yīng)狀態(tài)下PSII的有效吸收截面;Fo光適應(yīng)下的基礎(chǔ)熒光。)

            為了證明該方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行,即受非光化熒光淬滅影響很小、測量快速并且穩(wěn)定、具有時(shí)間分辨性、可應(yīng)用于對(duì)湖泊和海洋水體的初級(jí)生產(chǎn)力的快速評(píng)估,該研究進(jìn)行了209次成對(duì)測定,對(duì)不同培養(yǎng)和處理?xiàng)l件下的海洋藍(lán)藻、分別在高光和低光處理下的原生態(tài)型球藻、北極和溫帶的綠藻、兩種中心硅藻進(jìn)行測試。

            由于藻類的生理狀態(tài)對(duì)培養(yǎng)密度、光照條件、氣體狀態(tài)、溫度、pH值等都很敏感,進(jìn)而直接影響所得參數(shù)和公式的科學(xué)性,所以需要精確控制培養(yǎng)條件并實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)狀態(tài)。因此本研究使用FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器對(duì)中心硅藻兩個(gè)藻株分別在2種不同狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)和監(jiān)測,精確控制營養(yǎng)濃度、溫度、光照,并自動(dòng)進(jìn)行恒化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中儀器自動(dòng)使用水蒸氣飽和的空氣氣泡混勻,避免沉降。(FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器介紹見后附

            之后使用FL3500(當(dāng)前升級(jí)為FL6000)測量每個(gè)樣品的Foσ’PSII,用以計(jì)算[PSII]active。FL3500可自動(dòng)控制和測量樣品溫度、預(yù)施光照、光化光、單周轉(zhuǎn)飽和光閃、QA再氧化等8種默認(rèn)測量程序、精確自定義程序等。

            同時(shí)使用熒光光纖氧氣傳感器測量密閉比色皿里樣品的溶氧濃度。氧氣的測量可由儀器自帶軟件程序自動(dòng)控制。

            放氧測量過程如下圖所示:在FRR測量過程中,氧氣濃度隨激發(fā)光變化并與時(shí)間(橫軸)相對(duì)應(yīng)。將氧探頭固定在FL3500自動(dòng)控溫探頭上,一同插入FL3500測量單元內(nèi)的待測樣品中。FL3500具有磁力攪拌功能,該功能可由觸控面板控制,也可由FL3500自帶軟件FluorWin程序精確定義。

             在初始300s的暗適應(yīng)過程中記錄氧氣濃度作為暗呼吸值;之后用低光(20 µmol.m-2.s-1)進(jìn)行預(yù)光照激活光系統(tǒng)并測量氧氣;在一個(gè)FRR程序結(jié)束后立刻測量氧氣濃度作為在FRR過程中的呼吸。二者差值用于估算樣品中[PSII]active含量。

            之后將樣品置于光下300 s;再次進(jìn)行FRR誘導(dǎo)(見下圖)并測量氧濃度。再次估算樣品中[PSII]active含量。公式為:

    μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×(25.025×10-3s Flash-1)×(4 Flash 1×1 PSII/O2)

     

            FRR測量過程如下圖所示:先進(jìn)行300 μs的暗適應(yīng)。預(yù)光照之后使用40個(gè)(間隔2 μs)單周轉(zhuǎn)光閃(1.2 μs, 65000 µmol.m-2.s-1)的激發(fā)序列進(jìn)行FRR誘導(dǎo),以逐漸關(guān)閉全部PSII;在這個(gè)過程中得到Fo、FM、σPSII、ρ(表示PSII 光反應(yīng)中心的連通性)。之后降低光閃重復(fù)速率,PSII逐漸打開,此過程持續(xù)0.25 s。黑暗2 s,PSII打開。再施加第二次FRR誘導(dǎo),得到Fo2、FM2sσ’PSII2s……

     

            使用放氧法得到的[PSII]active對(duì)FRR得到的 [PSII]active=Fo/σ’PSII 公式進(jìn)行校正,得到校正參數(shù)。

            本研究驗(yàn)證了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假設(shè),應(yīng)用FRR測量得到的[PSII]active矯正公式適用于本文所述所有藻類樣品,包括:呈指數(shù)增長的樣品、短期生理波動(dòng)的非穩(wěn)態(tài)樣品、光抑制樣品、低濃度樣品、光適應(yīng)下的樣品,并且受非光化熒光淬滅影響很小。

             因此可以用FRR測量程序來估算湖泊和海洋不斷變化的環(huán)境中的初級(jí)生產(chǎn)力。

            本案例文獻(xiàn): Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.10142

    1. 本研究應(yīng)用的FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng): 詳見北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司網(wǎng)站

     

            FMT150 光氧生物反應(yīng)器為捷克PSI公司生產(chǎn),北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司為PSI公司在中國的*家代理。FMT150容量分為400ml、1000ml、3000ml。另有訂制大型版。

            FMT150將生物反應(yīng)器與監(jiān)測儀器*地結(jié)合在一起,用于淡水、海水藻類和藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)藻)等的模塊化精確光照培養(yǎng)與生理監(jiān)測。

    ü 控制單元:包括電腦與預(yù)裝軟件。用戶自定義程序自動(dòng)改變培養(yǎng)條件并實(shí)時(shí)在線監(jiān)測培養(yǎng)條件與測量參數(shù)。光強(qiáng)、光質(zhì)、溫度和通入氣體的組分與流速都可以精確調(diào)控。恒濁和恒化控制模塊用于自動(dòng)調(diào)控培養(yǎng)基的pH值和濁度??刂茊卧赏瑫r(shí)控制多臺(tái)FMT150進(jìn)行同步實(shí)驗(yàn),保證不同處理實(shí)驗(yàn)間的一致性。

    ü 監(jiān)測單元:包括溶氧、CO2pH、培養(yǎng)光強(qiáng)、溫度、OD 680OD 720、以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)Ft、Fo、Fm、Fm′和QY。

     

    2. 本研究應(yīng)用的氧氣實(shí)時(shí)測量解決方案請(qǐng)咨詢北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司:

     

    3. 本研究中FRR(該功能須提前訂制)測量儀器:FL3500 (當(dāng)前已升級(jí)為FL6000):

    詳細(xì)見北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司易科泰網(wǎng)站

     

            FL6000 雙調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x為捷克PSI公司生產(chǎn),北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司為PSI公司在中國的*家代理。標(biāo)準(zhǔn)版和快速版。本研究應(yīng)用的FRR測量程序?yàn)榭焖侔嫣峁?/span>

            具備雙通道測量控制,一個(gè)通道用于對(duì)藍(lán)綠藻或綠藻等微藻,葉綠體或類囊體懸浮物、葉片碎片進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y量;另一個(gè)可選擇使用:測量和控制樣品溫度或者氧氣。此外可選配遠(yuǎn)紅光源(735 nm)、磁力攪拌等功能。

            FL6000的測量單元提供毫秒級(jí)低強(qiáng)度測量光閃、超短單周轉(zhuǎn)光、以及持續(xù)光化光,三者的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間全部可通過軟件實(shí)現(xiàn)非周期的精確編程控制。檢測器為500 kHz/16位 AD 轉(zhuǎn)換的PIN二極管信號(hào)檢測器,測量葉綠素?zé)晒庑盘?hào)的時(shí)間分辨率可高達(dá)4 µs(快速版為1µs)。AD轉(zhuǎn)換的增益和積分時(shí)間同樣可以通過軟件精確控制。

            內(nèi)置測量程序如下:

     

            應(yīng)用領(lǐng)域:光合自養(yǎng)生物懸浮物生理研究、PSII光化學(xué)效率測量、水體初級(jí)生產(chǎn)力估算、浮游植物的光合作用和代謝擾動(dòng)、藻華研究、藻類抗脅迫能力或者易感性研究、光合系統(tǒng)工作機(jī)理研究、受脅迫植物光合生理應(yīng)對(duì)策略研究等。

     

            北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司是由科學(xué)家創(chuàng)建并為科學(xué)家提供科技服務(wù)的新技術(shù)企業(yè),是PSI公司在中國的*家代理和技術(shù)咨詢服務(wù)中心。易科泰生態(tài)技術(shù)公司在青島、西安設(shè)有分公司,在全國各地設(shè)有辦事處,北京總部設(shè)立有 EcoLab 實(shí)驗(yàn)室以提供實(shí)驗(yàn)研究合作、儀器技術(shù)培訓(xùn)等。